Sob encomenda do Ministério de Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI), desde dezembro de 2015, o Laboratório de Química Orgânica Sintética (LQOS) do Instituto de Química da UNICAMP – coordenado pelo Prof. Dr. Luiz Carlos Dias, em colaboração com o Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas(LASSBio), do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ – coordenado pelo Prof. Eliezer Barreiro, ambos vinculados ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fármacos e Medicamentos (INCT-INOFAR), analisou os componentes químicos das cápsulas de fosfoetanolamina oriundas do Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo (IQSC-USP). Os trabalhos de análise das cápsulas de fosfoetanolamina e os ensaios de síntese da fosfoetanolamina no LQOS do IQ-UNICAMP tiveram a colaboração do pós-doutorando Dr. Marco Aurélio Dessoy. Em paralelo, a segurança e a eficácia da molécula vêm sendo estudadas pelo Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Medicamentos da Universidade Federal do Ceará (NPDM/UFC), de Fortaleza, e peloCentro de Inovação de Ensaios Pré-Clínicos (CIEnP), de Florianópolis.
O LQOS no IQ-UNICAMP recebeu 3 lotes distintos de fosfoetanolamina encaminhados pelo IQSC-USP ao MCTI. Nos dois primeiros lotes, o LQOS recebeu um total de 63 cápsulas e no terceiro lote recebeu uma alíquota de 1,3296 g de fosfoetanolamina a granel, de um lote integral de 282,97 g enviados pelo IQSC-USP ao MCTI.
O relatório completo elaborado pelo Grupo de Trabalho convidado pelo MCTI está disponível desde março de 2016 no site do órgão Ministerial sob o link, de amplo acesso a todo e qualquer cidadão.
O trabalho realizado no Laboratório de Química Orgânica Sintética (LQOS) no IQ-UNICAMP, envolveu a análise química do conteúdo das cápsulas de “fosfoetanolamina sintética” produzidas pelo IQSC-USP e enviadas pelo MCTI ao LQOS-UNICAMP. Como complementação ao trabalho de análise, descrito na parte A do relatório, foram realizados ensaios de síntese da fosfoetanolamina a partir do ácido fosfórico e da monoetanolamina, com base no procedimento descrito na patente PI0800460-9 A2, sendo descritos na parte B do relatório.
Peso do material contido nas cápsulas
Destaca-se a grande variação em peso encontrada nas cápsulas de fosfoetanolamina fornecidas pelo IQSC-USP e encaminhadas ao LQOS no IQ-UNICAMP. O conteúdo das cápsulas apresentou os seguintes pesos: 233 mg, 273 mg, 278 mg, 304 mg, 316 mg, 317 mg, 325 mg, 328 mg, 331 mg, 342 mg, 345 mg, 348 mg, 352 mg, 358 mg, 359 mg, 368 mg, 480 mg, 503 mg e 509 mg. O peso declarado para o conteúdo das cápsulas é de “fosfoetanolamina sintética, 500 mg”.
Isto mostra um processo artesanal de preenchimento das cápsulas, que pode estar sendo feito por máquina semiautomática de precisão notoriamente baixa. A constatação da existência de cápsulas contendo um pouco a mais de 50% do peso indicado (500 mg) não pode ser negligenciada, pois é preciso ter em mente que está sendo oferecido à população um “tratamento médico”, sendo que ao menos a premissa do conhecimento exato da quantidade e da composição do “principio ativo” administrado deveria ser atendida.
Análise do conteúdo das cápsulas
A análise gravimétrica demonstrou que o conteúdo das cápsulas apresenta cerca de 7,2% de água, cerca 35,5% de material insolúvel em água e cerca de 57,3% de material solúvel em água (essa relação muda levemente em função da relação massa seca/volume de água que é utilizada para a análise gravimétrica).
As cápsulas foram abertas no LQOS e o material nelas contido foi imediatamente pesado. A absorção de água pelo material higroscópico das cápsulas pode ocorrer durante o processo de encapsulamento e/ou durante o acondicionamento das mesmas pelo grupo do IQSC-USP. A presença de água no material contido nas cápsulas não tem por si só maior implicação, salvo o fato dela contribuir para a redução ainda maior da massa efetiva de fosfoetanolamina presente nas cápsulas, que já é bem inferior ao indicado pelos responsáveis pela produção.
A análise de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1, de Carbono-13 e de Fósforo-31 (RMN-1H, RMN-13C e RMN-31P) do conteúdo integral das cápsulas de fosfoetanolamina fornecidas pelo IQSC-USP-MCTI e encaminhadas ao LQOS via CIEnP e via LASSBio, permitiu a identificação de 05 (cinco) compostos presentes nas cápsulas de “fosfoetanolamina sintética” (figura 1).
Pode-se observar a presença de 04 (quatro) compostos contendo fósforo em sua estrutura: (1) a própria fosfoetanolamina (FOS) na forma de seu sal; (2) fosfatos inorgânicos (de cálcio, de magnésio, de zinco, de manganês, de ferro, de alumínio e de bário); (3) pirofosfatos inorgânicos (de cálcio, de magnésio, de zinco, de manganês, de ferro, de alumínio e de bário) e (4) fosfobisetanolamina protonada (FBEA.H+), um diéster do ácido fosfórico (ácido fosfórico esterificado com dois resíduos de monoetanolamina). O quinto componente contido nas cápsulas é uma espécie protonada da monoetanolamina (MEA.H+), um dos reagentes usados para a síntese da fosfoetanolamina.
O conteúdo de cada cápsula IQSC-USP analisada no LQOS apresenta composição aproximada (com base em peso) de:
Figura 1. Espécies químicas presentes nas cápsulas de fosfoetanolamina fornecidas pelo IQSC-USP. A FOS encontra-se, em grande extensão, neutralizada pela MEA e FBEA.
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O material solúvel em água é constituído de fosfoetanolamina, monoetanolamina (protonada) e fosfobisetanolamina (protonada), além de pequena quantidade de fosfatos de cálcio e de magnésio.
O material insolúvel em água apresenta pequena quantidade de fosfoetanolamina residual; pequena quantidade de pirofosfatos de cálcio, magnésio, manganês, alumínio, ferro, bário e zinco; pequena quantidade de fosfatos de magnésio, manganês, alumínio, ferro, bário e zinco; e uma grande quantidade de fosfato de cálcio.
A presença de todos os compostos detectados nas cápsulas IQSC-USP pôde ser confirmada através dos ensaios de síntese realizados no LQOS.
Todos os 05 componentes (fosfoetanolamina, fosfobisetanolamina, monoetanolamina, fosfatos e pirofosfatos) estão presentes nos 3 lotes, com a agravante de que no terceiro lote (a granel), a proporção de monoetanolamina é ainda maior do que nos dois lotes anteriores. A razão molar entre FOS e MEA neste último lote é de 100:90, respectivamente.
Neste ponto cabe esclarecer que estas impurezas foram detectadas e identificadas através das técnicas de ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 (RMN-1H), de carbono-13 (RMN-13C) e de fósforo-31 (RMN-31P), técnicas reconhecidamente não destrutivas e extremamente brandas. Para sua execução, as amostras foram tão somente suspensas em água deuterada (D2O) e filtradas através de filtro de papel por gravidade, à temperatura ambiente, uma vez que o material contido nas cápsulas não é completamente solúvel em água. Assim sendo, a presença dessas substâncias nas amostras analisadas não pode, em hipótese alguma, ser resultado de decomposição da fosfoetanolamina durante o processo de análise por RMN. Na realidade, tanto a fosfobisetanolamina quanto o ácido pirofosfórico são formados durante o processo de síntese da fosfoetanolamina a partir do ácido fosfórico e da monoetanolamina a altas temperaturas (supostamente a 200 °C, conforme descrito pelos detentores da patente do processo de síntese da “fosfoetanolamina sintética”) e detalhado a seguir.
Para eliminar de vez a possibilidade de degradação, conforme apresentado nas páginas 93-99 do relatório completo, tanto a fosfoetanolamina como a fosfobisetanolamina preparada no Laboratório de Química Orgânica Sintética (LQOS) com alto grau de pureza, foram submetidas exatamente às mesmas análises de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio-1 (RMN-1H), de carbono-13 (RMN-13C) e de fósforo-31 (RMN-31P), no mesmo solvente (D2O). Estas análises foram realizadas da mesma maneira e não apresentaram nenhum sinal de degradação, apresentando agora sim, pureza próxima a 98% como determinada por estas técnicas, dentro do erro experimental. Além, disto, utilizamos outras técnicas para comprovar a estrutura química destes dois compostos como espectrometria de massas e, inclusive, difração de raios-x de monocristais no caso da fosfoetanolamina. Durante o período relativamente curto para a realização desses estudos, não foi possível obter a fosfobisetanolamina numa forma cristalina adequada que permitisse sua caracterização por meio de difração de raios-x de monocristal. Pelas análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV, adquiridos em modo ATR) observou-se que o material sólido contido nas cápsulas apresenta um espectro que praticamente se sobrepõe ao espectro adquirido para a mistura de FOS/MEA 100:70 obtida a partir da FOS pura sintetizada no LQOS e MEA comercial. Esses dois espectros de IV são muito diferentes do espectro adquirido para a FOS pura sintetizada no LQOS, que por sua vez é condizente com o espectro de IV da FOS reproduzido pelo Grupo do IQ-SC no corpo da patente PI0800460-9 A2.
Todas essas observações estão detalhadas ao longo do relatório completo publicado no site do MCTI.
Síntese da fosfoetanolamina
Com relação à síntese da fosfoetanolamina monitorou-se o progresso da reação ao longo do tempo, por meio de ressonância magnética nuclear de fósforo-31 (RMN-31P), à medida que a temperatura interna do sistema se elevava a 220 °C (temperatura ótima para garantir um rendimento reacional de 90%, segundo os autores da patente PI0800460-9 A2).
Monitorando o progresso da reação em diferentes intervalos de tempo, no início, nós observamos um incremento na formação de fosfoetanolamina, fosfobisetanolamina e pirofosfatos. Contudo, à medida que o tempo reacional e a temperatura aumentam, observa-se um leve declínio na quantidade de fosfoetanolamina e fosfobisetanolamina presentes na mistura reacional, ao passo que a formação de pirofosfatos tem um forte incremento.
Os resultados desse experimento induzem à conclusão de que dificilmente a fosfoetanolamina bruta, ainda sem purificação por recristalização, poderá ser obtida com rendimento que chegue sequer próximo aos 90% reivindicados pelos autores, a partir do processo descrito.
O processo de produção da fosfoetanolamina pelo grupo do IQSC-USP envolve aquecimento da mistura reacional, provavelmente a uma temperatura interna inferior a 220 °C (temperatura informada na patente PI0800460-9 A2) por um determinado período. O produto bruto dessa reação passa por um processo de purificação (cristalização) de baixa eficiência, onde somente algumas impurezas presentes em menor proporção são removidas da mistura. O produto resultante desse processo, supostamente fosfoetanolamina pura, é, na realidade, uma mistura compreendendo fosfoetanolamina, a fosfobisetanolamina, o sal dihidrogenofosfato de monoetanolamônio não convertido durante o processo e trihidrogenopirofosfato de monoetanolamônio.
Essa mistura é então neutralizada com carbonatos de cálcio, de magnésio e de zinco em suspensão aquosa e deixada para secar em estufa a 70 °C, processo durante o qual, parte da fosfoetanolamina é hidrolisada (formando fosfatos e monoetanolamina). O material sólido seco (higroscópico) resultante é encapsulado e rotulado como “sal de fosfoetanolamina” ou “fosfoetanolamina sintética”. Na prática, os carbonatos de íons divalentes neutralizam o sal ácido de ácido fosfórico não convertido na reação e o pirofosfato nela formado, levando à formação de fosfatos e pirofosfatos de cálcio (e de magnésio e zinco), que são praticamente insolúveis em água, dando lugar ao material insolúvel da cápsula que equivale a cerca de 35,5% do conteúdo total. A parte solúvel em água é constituída, principalmente, de fosfoetanolamina, que possui propriedades ácidas, e está associada à monoetanolamina não convertida durante a reação e à fosfobisetanolamina formada na reação numa interação do tipo ácido-base.
Fica claro que o processo de purificação da fosfoetanolamina preparada no IQSC-USP é extremamente ineficiente. O rendimento declarado de 90% na obtenção de fosfoetanolamina não é possível de ser alcançado em virtude da formação de vários outros compostos além de fosfoetanolamina, conforme demonstrado pelo monitoramento do progresso da reação por meio de ressonância magnética de fósforo-31 (RMN-31P). Ao contrário do que é descrito na patente PI0800460-9 A2, este procedimento não permite a obtenção de altos rendimentos da fosfoetanolamina. A baixa taxa de conversão do sal dihidrogeno fosfato de etanol amônio, bem como a co-formação de ácido pirofosfórico e pirofosfatos, da fosfobisetanolamina, além de outros produtos secundários não permitem a obtenção de fosfoetanolamina pura em 90% de rendimento. A temperaturas mais altas, próximas de 220 oC, ocorre a desidratação do ácido fosfórico ao ácido pirofosfórico e a pirofosfatos orgânicos (ésteres do ácido pirofosfórico). A temperaturas mais elevadas, a água liberada no processo de desidratação promove a hidrólise parcial da fosfoetanolamina e da fosfobisetanolamina previamente formadas a temperaturas mais baixas.
Tanto o ácido fosfórico comercial, como a monoetanolamina comercial, utilizados no processo de síntese química no LQOS são livres de impurezas. Todos os produtos e subprodutos formados no processo de síntese química realizados no LQOS são originários de reações químicas entre o ácido fosfórico comercial e a monoetanolamina nas condições de reação.
Análise da presença de íons metálicos
O conteúdo das cápsulas de “fosfoetanolamina sintética” provenientes do IQSC-USP foi analisado no laboratório de pesquisas no IQ-Unicamp através da aplicação da técnica de espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES), com o objetivo de quantificar a presença de íons Ca2+, Mg2+ e Zn2+ e eventualmente outros metais. Todas as análises foram feitas em triplicata. A análise do conteúdo das cápsulas provenientes do IQSC-USP foi feita seguindo os procedimentos exigidos para a análise de traços de metais. As amostras foram pesadas e, a seguir, tratadas unicamente com ácido clorídrico, que as dissolveu completamente. O mesmo ácido foi utilizado também para verificar o branco da curva analítica. Para isto foi usada a mesma porcentagem de ácido utilizada na dissolução do conteúdo das cápsulas. Na etapa de determinação dos analitos, por ICP OES, observou-se que a intensidade do sinal do branco é pequena, muito inferior à resposta analítica obtida para a solução do material das cápsulas, para todos os analitos estudados. Além disso, o sinal do branco foi subtraído do sinal da amostra, para todos os analitos. Desta forma, exclui-se TOTALMENTE a possibilidade de contaminação da amostra durante a análise.
Pelo processo de síntese utilizado pelo grupo do IQSC-USP, a última etapa consiste na adição de carbonato de cálcio (CaCO3), carbonato de zinco (ZnCO3) e carbonato de magnésio (MgCO3), à uma solução da fosfoetanolamina supostamente pura em água, com o objetivo de neutralizar a acidez da fosfoetanolamina e preparar a “fosfoetanolamina sintética”. Segundo os autores, a “fosfoetanolamina sintética” seria um sal de fosfoetanolamina ligada aos íons Ca2+ Mg2+ e Zn2+, obtida após tratamento térmico da mistura por 5 dias a 70 ºC.
Este procedimento não fornece os sais de “fosfoetanolamina sintética” como o grupo do IQSC-USP alega, mas leva unicamente à:
1. neutralização do ácido fosfórico residual não convertido no processo de síntese, nem eliminado no processo de purificação e;
2. à hidrólise parcial da fosfoetanolamina, fornecendo a monoetanolamina e fosfatos dos íons metálicos de Ca2+, Mg2+ e Zn2+ e de outros elementos que são todos detectados nas cápsulas do IQSC-USP. O sal de “fosfoetanolamina sintética” associado aos íons Ca2+, Mg2+ e Zn2+ é formado apenas em pequena quantidade, cerca de 6,2%, conforme descrito nas páginas 28-30, 37-40, 44-49 e 108-115 do relatório completo.
Não nos surpreende a presença dos íons Ca2+, Mg2+ e Zn2+ nas cápsulas do IQSC-USP, pois estes advêm do próprio processo de síntese. O que surpreende é a presença dos íons Al3+, Fe3+, Mn2+ e Ba2+.
Embora apenas o grupo do IQSC-USP, responsável pela produção de “fosfoetanolamina sintética” possa responder a esta questão, acreditamos que a presença dos íons Al3+, Fe3+, Mn2+ e Ba2+ possa estar relacionada ao fato destes estarem presentes como impurezas no carbonato de cálcio (CaCO3), no carbonato de zinco (ZnCO3) ou no carbonato de magnésio (MgCO3) utilizados pelo grupo do IQSC-USP ou até mesmo pela possibilidade dos autores não estarem utilizando água destilada nos procedimentos experimentais ou pela limpeza inadequada das vidrarias e demais equipamentos utilizados no processo de síntese.
Todos os espectros de RMN-1H, de RMN-13C, de RMN-31P, de infravermelho e de espectrometria de massas, assim como de difração de raios-x de monocristal, no caso da fosfoetanolamina pura preparada no LQOS, contém as respectivas datas de realização. Por medidas de segurança, o relatório completo foi publicado no site do MCTI com baixa resolução.
Como comprovado pelo relatório completo publicado no site do MCTI, o material contido nas cápsulas de “fosfoetanolamina sintética” que vem sendo produzidas pelo grupo do Prof. Chierice no IQSC-USP e que está sendo distribuído para a população é de fato muito impuro. Mesmo que a fosfoetanolamina preparada na primeira etapa estivesse pura (e não está), o próprio grupo do IQSC-USP degrada a fosfoetanolamina quando submete esta ao tratamento com carbonatos de cálcio, magnésio e zinco por 5 dias a 70 ºC, levando a uma mistura de fosfoetanolamina, + monoetanolamina, + fosfatos. A fosfobisetanolamina e os pirofosfatos vem da primeira etapa, pois o processo de recristalização é ineficiente e remove apenas parte das impurezas. O grupo do IQSC-USP aparentemente desconhece isto.
Compostos preparados no LQOS e enviados ao CIEnP para testes clínicos
Os compostos mostrados abaixo, com altíssimo grau de pureza foram preparados no LQOS e enviados ao CIEnP para testes pré-clínicos (figura 2).
Figura 2. Compostos foram preparados no LQOS e respectivas quantidades, enviados ao CIEnP para testes pré-clínicos.
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