بیوشیمی

کشت سلول:
کشت یاخته به فرایند کشت کنترل شده یاختههای پروکاریوتی یا یوکاریوتی در محیط کشت، بکار می‌رود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت یاخته‌های جانوران پر یاخته‌ای کاربرد دارد.
تاریخچه:
هاریسون اولین كسی بود كه با ابداع تكنیك قطره معلق توانست سلول عصبی قورباغه را كشت دهد. او در سال 1907 قطعه ای از بافت عصبی جنین قورباغه را درون مایع لنف قرار داد سپس این لام را بطور وارونه بر روی یك لام گود قرار داد و اجازه داد تا مایع لنف منعقد گردد. او برای جلوگیری از خشك شدن قطره لنف اطراف لام را با موم پوشاند و بدین ترتیب توانست رشد سلول های عصبی جنین قورباغه را در قطره مذكور به مدت چندین هفته با میكروسكوپ نوری مورد بررسی قرار دهد.
بعد از هاریسون Carrel و Burrows توانستند با كنترل شرایط استریل، سلول ها را برای چندین سال بدون آلودگی كشت دهند. آنها با استفاده از مخلوطی از عصاره جنین جوجه و پلاسما شرایط مناسبی برای رشد و بقاء سلول ها فراهم نمودند. در سال1923 فلاسك های T شكل توسطCarrel معرفی شد. این فلاسك ها ظروف كوچكی با كف صاف بودند كه موجب حفظ شرایط استریل می شدند.
انواع کشت سلولی:
کشت عضو
کشت اولیه
کشت سلولی پیوسته
کشت عضو:
کشت عضو به معنی نگهداری یک عضو یا قسمتی از آن در محیط کشت برای حفظ خصوصیات بافتی عضو موردد نظر است.با توجه به عدم امکان تکثیر عضو و مشکلات مربوط به اکسیژن رسانی و تغذیه سلول های درون بافت این کار برای مدت کوتاهی استفاده می گردد.
با توجه به عدم فعالیت سیستم عروقی بافت و عدم اکسیژن رسانی و تغذیه بافت و لذا نکروز قسمت هایی از عضو این کار در بطری غلطان و یا کشت های اسپن دار صورت می گیرد.
کشت سلولی اولیه:
در این روش بافت تکه برداری شده را به صورت قطعات ریز دراورده و بر روی بستر مناسبی کشت می دهند.بهتر است سلول ها به کمک روش آنزیمی مناسبی مانند آنزیم پروتئلیتیک کلاژناز یا عبور از الکهای پلاستیکی استریل آزاد شده و کشت داده شوند.کوچک بودن قطعات بافتی موجب اکسیژن رسانی و تغذیه مناسب سلولی و ممانعت از نکروز می گردد.
برای بهتر چسبیدن بافت به کف فلاسک می توان بستر مورد نظر را با کلاژن پوشاند.
سلول های حاصل به صورت تک لایه روی سطح جامد می چسبند یا به صورت شناور درون یک سوسپانسیون سلولی رشد می کنند.
افزودن فاکتور رشد یا تعویض محیط روی سلول ها شرایط رشد را اختصاصی تر می کند.
سلول های حاصل از این نوع کشت عمر محدودی دارند.
از این روش برای تهیه تیره های سلولی استفاده می گردد.
با توجه به استحصال این سلول ها از بافت جانواران یا جنین آنها عملکرد و خصوصیات آنها شبیه سلول های طبیعی است.
کشت سلولی پیوسته:
این کشت از تکثیر یک سلول منفرد که می تواند به صورت محدود یا نامحدود تقسیم شود بدست می آید.
منابع بافتی مناسب برای کشت سلولی:
جنین عمر
بیشتری دارند و بهتر رشد می کنند و همه قسمت های آن را می توان کشت داد
بافت بالغین
به علت تمایز کامل و عدم توانایی برخی از سلول ها برای تکثیر و تولید سلول همسان مشکل است.شروع تکثیر دیرتری دارند و عمر کوتاه تری دارند.
کاربرد های کشت سلولی:
1-مطالعه سلول ها از نظر نحوه رشد ، نیاز های غذایی ، و علل توقف رشد و در نهایت توسعه روش های کنترل رشد سلول های سرطانی و تعدیل بیان ژن ها
2-مطالعه سیر تکامل جانواران از یک سلول لقاح یافته به یک جاندار پر سلولی
3-مطالعات ژنتیکی ، تزریق ژن به ژنوم سلولهای بنیادی رویانی و تولید حیوانات ترانسژنیکی که بتوانند ژنهای خاصی را بیان نمایند
4-ممزوج کردن سلول ها و تولید آنتی بادی های مونوکلونال
5-آزمایشات سم شناسی
6-تولید واکسن های ویروسی
7-مطالعه فعالیت های داخل سلولی از قبیل تکثیر دی ان ای و سنتز آر ان ای ، سنتز پروتئین ها و جزئیات مربوط به متابولسیم
8-مطالعه برهم کنش سلول ها
9-مطالعه محصولات تهیه شده توسط سلول ها
محاسن کشت سلولی:
1-تولید مقادیر متنابهی سلول همسان و یک دست
2-بررسی تاثیر دارو ها ، مواد شیمیایی و امواج بر روی سلولها بدون نیاز به موجود زنده باعث کاهش مخاطرات تحقیق برای موجودات زنده شده و هزینه استفاده از حیوانات آزمایشگاهی را کاهش می دهد.
ضمنا باعث احترام به قوانین و اصول اخلاق پزشکی می گردد.
3-امکان فریز کردن سلول ها و ذوب مجدد آنها مشکل پیر شدن حیوانات ، تاثیر هموستاز طبیعی حیوان و استرس ناشی از آزمایشات در یک امر تحقیقاتی را مرتفع می نماید.
4-با کنترل شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط زندگی سلول ها همجون اسیدیته ، حرارت ، فشار اسمزی و فشار گازهایی نظیر اکسیژن و دی اکسید کربن ،استاندار نمودن آزمون های آزمایشگاهی نسبت به آزمون روی موجودات زنده ساده تر و عملی تراست.
5-امکان تولید آنتی بادی های مونوکلونال با توجه به اینکه در حیوانات تنها امکان تولید آنتی بادی های پلی کلونال وجود دارد.
کشت سلول بنیادی:
جنین ۳ تا ۵ روزه را بلاستوسیست می‌نامند. یک بلاستوسیست توده‌ای مشکل از ۱۰۰ سلول و یا بیشتر است. سلولهای بنیادی سلولهای درونی بلاستوسیست هستند که در نهایت به هر سلول، بافت و اندام درون بدن تبدیل می‌شوند.
رشد سلول‌های بنیادی در محیط آزمایشگاه را اصطلاحا کشت سلولی می‌نامند.در واقع جدا کردن سلول‌های بنیادی جنینی از طریق انتقال سطح داخلی بلاستوسیست به یک ظرف کشت آزمایشگاهی پلاستیکی که شامل یک بستر تغذیه‌ای به نام محیط کشت می‌باشد انجام می‌گیرد. تقسیم و ازدیاد سلول‌ها بر روی سطح این ظرف انجام می‌گیرد. سطح داخلی این ظرف معمولاً به وسیله سلول‌های پوست جنین موش پوشیده شده‌است. این سلول‌ها قادر به تقسیم شدن نیستند. به این لایه پوشاننده سلولی در اصطلاح لایه تغذیه‌ای (feeder layer) گفته می‌شود. دلیل استفاده از این سلول‌ها فراهم آوردن یک سطح طبیعی به منظور چسپیدن سلول‌های بنیادی به آن و عدم جداشدنشان است. در ضمن سلول‌های این لایه مواد مغذی را به داخل محیط کشت رها می‌کنند.
ویژگی های سلول بنیادی:
توان نوسازی : سلول‌های بنیادی سلول‌های نامتمایزی هستند که توانایی تکثیر نامحدود خود را دارند و در حالت نامتمایز باقی بمانند.
پرتوانی : سلول‌های بنیادی قادر به ایجاد هر نوع سلولی در بدن هستند. آنها می‌توانند تحت تأثیر فاکتورهای رشد مختلف در محیط کشت به سلول‌هایی با عملکردهای اختصاصی مانند سلول‌های ماهیچه‌ای قلب یا سلول‌های تولیدکننده انسولین در پانکراس و... تبدیل شوند.
انواع سلول های بنیادی:
سلول‌های بنیادی جنینی : این سلول‌ها از جنین‌های ۴ یا ۵ روزه که از تخم‌های آزمایشگاهی بارور می‌شوند به دست می‌آیند و در محیط آزمایشگاهی در محیط کشت‌های اختصاصی رشد داده می‌شوند.
سلول‌های بنیادی بالغین : سلول‌های بنیادی بالغین، سلول‌های نامتمایزی هستند که در بین سلول‌های تمایز یافته بافت‌ها و اندام‌های بدن یافت می‌شوند و توانایی نوسازی و تمایز به انواع سلول‌های اختصاصی اصلی بافت یا اندام را دارند. نقش‌های اولیه این سلول‌ها در یک ارگان زنده شامل حمایت کردن و تعمیر بافت‌هایی است که از آنها به دست می‌آیند.
سلول های بنیادی خون بند ناف : خون بند ناف خونی است که پس از تولد در بند ناف و جفت باقی می ماند و همراه آن به دور انداخته می شود. این خون علاوه بر سلول های خونی منبعی غنی از سلول های بنیادی خون ساز است. سلول های بنیادی خون ساز می توانند با جایگزین شدن در مغز استخوان فرد بیمار، تامین کننده سلول های خونی جدید باشند. ویژگی مهم سلول های خونی بند ناف عدم تکامل سلول های خونی از جمله لنفوسیت های آن است که در نتیجه احتمال رد پیوندهای انجام شده با این سلول ها در مقایسه با پیوندهای مغز استخوان بسیار کمتر خواهد بود. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده اند که سلول های بنیادی خونساز توانایی تمایز به سایر سلول ها را نیز دارند که می توانند افق جدیدی را برای درمان بیماری ها در آینده ای نه چندان دور ترسیم کنند.
کاربرد سلول های بنیادی:
بیماران قلبی : توصیه می‌شود برای افرادی که در مراحل وخیم بیماری قلبی بوده و در انتظار دریافت قلب پیوندی به‌سر می‌برند، در کنار تجویز داروهای سرکوب‌کننده سیستم ایمنی، از روش پیوند سلول‌های بندناف به‌عنوان یک روش کمکی استفاده کرد. بر این اساس، این ایده در دنیا مطرح شده‌است که نمونه
بیماران کبدی : در حال حاضر اگر بیماری دچارسرطان کبد باشد، جراح مجبور است برای جلوگیری از انتشار سرطان به بخش‌های دیگر بدن، بخش سرطانی کبد را نابود کند. برای این منظور معمولاً طی دو عمل جراحی هم‌زمان، خون ناحیه سرطانی کبد را قطع می‌کنند تا بافت آن را بازسازی کنند. شبیه سازی انسان مساله دیگر نیز مورد اختلاف شبیه سازی انسان است.
درمان ریزش مو
درمان قرنیه
تجهیزات اصلی کشت سلولی:
برخی تجهیزات و تکنیک های خاص جهت نگهداری کشت های سلولی مورد نیاز است. در واقع داشتن این امکانات بیشتر به معنای انجام هر چه بهتر فرآیند کشت سلول است.
محیط کار استریل
وسایل انکوباسیون
یخچال و فریزز (20 - )
میکروسکوپ
ظروف کشت
نیتروژن مایع / فریزر (70 - )
استریلیزاسیون فیلتری
امکانات شمارش سلولی
محیط کار استریل:
برای انجام کارهای مربوط به کشت سلول باید تا جایی که امکان دارد یک اتاق جداگانه در نظر گرفته شود. این اتاق باید عاری از هر گونه شلوغی بوده و در صورت امکان از یک تهویه هوای فیلتر شده در محیط کار برخوردار باشد. بافت اولیه حیوانی و میکروارگانیسم ها نباید در نزدیکی آزمایشگاه کشت سلول کشت شوند و باید یک آزمایشگاه جداگانه و اختصاصی برای کار کشت سلول به صورت استریل طراحی شود. پوشش های مخصوص آزمایشگاه کشت سلول باید در ورودی آزمایشگاه پوشیده شده و لباسی که از این محیط خارج می گردد نباید مجدداً وارد آزمایشگاه شود. در صورت نیاز به استریلیتی شدید یک هود لامینار جهت حفظ بهتر از شرایط استریل پیشنهاد می گردد. در صورت استفاده از یک ماده شیمیایی خطرناک باید از هود های ورتیکال یا عمودی استفاده گردد. به هر حال برای کشت های اولیه و در حالی که هیچ گونه هود لامینار یا اتاق استریل در دسترس نیست باید یک فضای استریل جهت انجام کار در نظر گرفت. اگر شیوه های سترونی یا استریلیزاسیون به درستی رعایت گردد و نظافت و نظم محیط حفظ شود، می توان تا حدی از محیط کار استریل آسوده خاطر بود.
وسایل انکوباسیون :
علاوه بر فیلتر های هوا و هود لامینار و میزهای کاری که تمیز کردنشان به راحتی صورت می گیرد، آزمایشگاه کشت سلول به یک انکوباتور برای نگهداری سلول ها در دمای 30 تا 40 درجه سانتیگراد هم نیاز خواهد داشت. دمای انکوباسیون به نوع سلول های کشت شده بستگی دارد. سلول های حشرات در دمای حدود 30 درجه بهترین رشد خود را دارند، در حالی که سلول های پستانداران به دمای حدود 37 درجه سانتیگراد نیاز دارند. استفاده از انکوباتورهایی که برای فراهم کردن CO2 از یک منبع اصلی یا سیلندر گاز استفاده می کنند ضروری به نظر می رسد، چرا که هوای درون انکوباتور باید همیشه بین 2 الی 5% CO2 داشته باشد.به طور کلی، لاین های سلولی بسیاری قادرند در اتمسفری حاوی 95% هوا و 5% CO2 و با رطوبت نسبی 99% قابلیت زنده ماندن خود را حفظ نمایند. غلظت CO2 باید در تعادل با کربنات سدیم محیط کشت باشد. محیط کشت های مختلف ظرفیت بافری متفاوتی دارند. در صورتی که یک انکوباتور مجهز به CO2 در دسترس نباشد به طور موقت می توان کشت ها را در یک فلاسک غیر قابل نفوذ حفظ نمود به این شکل که می بایست پس از گازدهی با CO2 فلاسک ها را به کمک نوار پارافیلم به خوبی مهر و موم نمایید.
میکروسکوپ :
از آنجا که کشت در فلاسک ها یا پلیت ها انجام می گیرد، یک میکروسکوپ نوری معکوس مورد نیاز خواهد بود. تشخیص تغییرات مورفولوژیکی در هر کشت بسیار حیاتی است چرا که این می تواند اولین نشانه ایجاد فساد در یک کشت باشد. یک میکروسکوپ نوری بسیار ساده با بزرگنمایی 100× برای کار روزمره شمارش سلولی کافی خواهد بود، هر چند میکروسکوپی با کیفیت بهتر برای آنالیز های کروموزومی یا کارهای رادیوگرافی خودکار مورد نیاز می باشد.میکروسکوپ معکوس همچنین برای بررسی فلاسک ها و پلیت های چند خانه از قسمت زیری هر ظرف به کار می رود. هر دو نوع میکروسکوپ باید مجهز به لنز های 10× و 20× بوده و برای میکروسکوپ های معمولی لنز های 40× 100× نیز کاربرد دارند. تجهیزات اضافی از جمله دوربین، دوربین ویدئویی CCD، آداپتور و ملزومات دیگر و امکانات UV نیز برای اهداف دیگر مورد نیاز هستند.
ظروف کشت:
ظروف یکبار مصرف پلاستیکی جهت انجام کشت انواع مختلفی دارند، اما معمول ترین آن ها ظروفی از جنس پلی استایرن می باشد. اگز چه تمام ظروف پلاستیکی یکبار مصرف برای کشت سلول باید به اندازه کافی رشد سلولی را فراهم آورند، اما حصول اطمینان از اینکه کشت در یک ظرف جدید هم قادر به رشد است یا خیر ضروری به نظر می رسد. آزمایشاتی که در این راستا صورت می گیرند، شامل منحنی های رشد و زمان رسیدن به یک لایه یکنواخت سلولی می باشد.
سلول ها می توانند در پتری دیش ها یا فلاسک هایی نگهداری شوند که مجهز به یک سری امکاناتند، از جمله اینکه می توان فلاسک ها را با CO2 گازدهی کرده و سپس آنها را محکم بسته ( غیر قابل نفوذ)، به طوریکه نیاز به استفاده از انکوباتور CO2 مرتفع گردد. این حالت خصوصاً زمانیکه انکوباتور به خوبی کار نمی کند مفید خواهد بود.
نیتروژن مایع / فریزر:
همواره چه برای لاین های سلولی که مکرراً تکثیر می شوند و چه لاین هایی که در نهایت از بین می روند، نمونه های از کشت جهت ذخیره سازی باید فریز شوند. این عمل به منظور ممانعت از جهش سلولی و محافظت از لاین سلولی در مقابل آلودگی و دیگر اتفاقات ناگوار صورت می پذیرد.
فرآیند فریز کردن سلول ها عموماً برای تمامی انواع سلولی صورت می گیرد. سلول ها باید در فاز تصاعدی رشد با یک نگهدارنده مناسب که معمولاً دای متیل سولفوکسید DMSO است فریز شوند. سلول ها معمولا ابتدا چند ساعت در 20- درجه قرار داده می شوند و سپس در نیتروژن مایع 196- درجه فرو برده می شوند ( در ویال های کوچک درب بسته ) یا اینکه در فاز گازی که در قسمت بالای مایع قرار دارد نگهداری می شوند. مواردی از تخریب و مرگ سلولی در 70- درجه مشاهده شده است، بنابراین اولیت استفاده از نیتروژن مایع است. ویال ها را می توان در یک جعبه پلی استایرنی با دیواره های 1 اینچی فریز نمود.
استریلیزاسیون فیلتری :
**محیط هایی که قابلیت اتوکلاو ندارند باید به واسطه عبور از یک فیلتر غشایی با قطر منافذ 22/0 استریل شوند. این فیلتر ها در اندازه ها مختلف به منظور فیلتراسیون طیف وسیعی از مواد با حجم های مختلف طراحی شده اند. این فیلتر ها می تواند به صورت یک بار مصرف و یا به صورت فیلتر هایی با قابلیت اتوکلاو همراه با یک نگهدارنده مناسب خریداری شوند. محیط های کشت، آنزیم ها، هورمون ها، کوفاکتور ها و بافرهای بیکربنات نمونه ای از این مواد غیر قابل اتوکلاو هستند.**
امکانات شمارش سلولی :
معمولترین وسیله مورد استفاده جهت انجام شمارش سلولی، لام نئوبار هموسایتومتر است که اساساً برای شمارش سلول های خونی طراحی شده است. این لام ضخیم از یک سری خطوط عمودی و افقی به صورت مشبک تشکیل شده که میانگین تعداد سلول ها در 4 خانه که خود از 16 خانه کوچکتر تشکیل یافته اند شمارش می گردد. سوسپانسیون سلولی پس از پیپتینگ مناسب جهت جدا شدن کامل سلول های چسبیده به هم در زیر لامل بر روی این لام لود می شود. پیپتینگ مناسب سوسپانسیون سلولی قبل از لود کردن بسیار اهمیت دارد، این کار به منظور دقت بیشتر و شکستن توده های سلولی به هم چسبیده که کار شمارش را با سختی مواجه می کند صورت می گیرد. تعداد سلو های شمارش شده در این خانه ها در 104 نشان دهنده میزان سلول ها در هر میلیمتر مکعب از سوسپانسیون است.

این فایل در قالب power point و به تعداد  25 اسلاید می باشد.